HiFi DNA Polimerase Concentração 2U/µl 100 U

HiFi  DNA Polimerase 100 U

Concentração: 2 U/µl

Condição de estoque: –20°C.

Apresentação:

1 frasco de HiFi DNA Polimerase 100 U
1 frasco de MgCl2 1 ml
1 frasco de Tampão 10X 1 ml

Descrição:

DNA polimerase de alta fidelidade que permite amplificação de sequências-alvos de DNA com maior acurácia graças à presença de um domínio exonucleásico, o qual atua na correção de bases incorporadas erroneamente. A enzima HiFi DNA polimerase é obtida a partir de expressão heteróloga de um gene de Pyrococcus sp. em E. coli. A enzima apresenta atividade de polimerase 5’�3’, atividade exonucleásica 3’�5’ e produz produtos com extremidades cegas (blunt-ended).

Tampão de estoque: 50% glicerol; 20 mM Tris-HCl (pH 7,6); 0,1 mM EDTA; 100 mM KCl; 1 mM DTT; 0,1% Tween-20.

Componentes:
Tampão de reação (10X concentrado): O tampão de atividade da HiFi DNA polimerase é composto de Tris-HCl pH 8,2, sais e BSA, desenvolvido para garantir a máxima eficiência da enzima. Livre de detergentes.
Solução de cloreto de magnésio (MgCl2, 25mM)

Protocolo básico de amplificação:

O protocolo descrito abaixo serve como uma orientação básica; as condições
ótimas da reação (tempos e temperaturas de incubação, a concentração dos primers, dNTPs e DNA-molde) variam e podem requerer otimização. Recomenda-se que a etapa de preparação da PCR seja realizada no gelo e os tubos ou placas imediatamente transferidos para o termociclador.

Componente Reação de 25 μl μl Reação de 50 μl μl Concentração final
Tampão 10X HiFi pol 2,5 μl 5 μl 1X
MgCl2 (25 mM) 0,75 μl 1,5 μl 0,75 mM
dNTPs (10 mM) 0,5 μl 1 μl 200 μM
Primer 1 (10 μM) 1,25 μl 2,5 μl 0,5 μM*
Primer 2 (10 μM) 1,25 μl 2,5 μl 0,5 μM*
HiFi polimerase 0,25 μl (0,5 U) 0,5 μl (1 U) 1 U/50 μl de reação
DNA-molde variável variável **
Água livre de nucleases para 25 μl para 50 μl

* A concentração de primers indicada para reações com polimerases de alta fidelidade é de 0,5 μM; concentrações de 0,2 μM a 1 μM podem ser utilizadas em alguns casos.
** Recomenda-se utilizar concentrações de 1 ng a 100 ng para DNA genômico e 10 pg a 20 ng para DNA plasmidial.

Parâmetros para ciclagem da PCR:

Etapa Temperatura Tempo
Desnaturação inicial 95°C 30 s – 2 min
25 – 35 ciclos

95°C 20 s – 45 s
50°C-72°C 20 s – 30 s
72°C 1 min – 2 min/kb
Extensão final 72°C 2 min – 10 min
Manter 4°C (-20°C para longos períodos)