PROBE qPCR Master Mix (100 reações x 25µL)
Código: 13-10506-01
Armazenamento: –20°C
Estabilidade: Este kit é estável durante 10 dias à temperatura ambiente.
Descrição
O PROBE qPCR Master Mix é um kit desenvolvido para ensaios de PCR quantitativos (qPCR) utilizando sondas fluorogênicas, incluindo as sondas TaqMan. Ele contém a enzima Hot Start Taq DNA Polimerase, uma polimerase recombinante complexada com um anticorpo monoclonal anti-Taq. Esse mecanismo bloqueia a atividade da enzima à temperatura ambiente, proporcionando um “início a quente” automático para aumentar a sensibilidade e especificidade da detecção.
Este kit foi otimizado para PCR em tempo real que exige alta sensibilidade e especificidade, sendo indicado para:
- Detecção e quantificação de agentes patogênicos;
- Identificação de organismos geneticamente modificados;
- Análise de expressão gênica.
O PROBE qPCR Master Mix é compatível com diversos instrumentos de PCR em tempo real, incluindo modelos que não requerem ROX:
- Roche: LightCycler 480
- Qiagen: Rotor-Gene Q / 3000 / 6000
- Eppendorf: Mastercycler ep / realplex
- Illumina: Eco qPCR
- Bio-Rad: CFX96 / CFX384, iCycler iQ / My iQ / IQ5
- Thermo Scientific: PikoReal Real-Time PCR
- Applied Biosystems: 7500 / 7500 Rápido / VIIa 7 / QuantStudio 12K Flex
- Stratagene: Mx3000P / Mx3005P / MX4000
- Bioer
Componentes do Kit
Cada kit contém reagentes suficientes para 100 reações com volume final de 25µL:
Código | Descrição | Volume | Quantidade |
---|---|---|---|
13-10506-01 | 2X PROBE qPCR Master Mix | 1.25 mL | 1 tubo |
– | Hot Start Taq DNA Polymerase | 50 µL | 1 tubo |
– | Amostra q.s.p 10 reações | – | – |
Protocolo
Este protocolo é para um volume final de reação de 25µL. O volume pode ser ajustado conforme necessário.
Preparo Inicial
- Descongelar os componentes à temperatura ambiente.
- Ressuspender o 2X PROBE qPCR Master Mix, primers e sonda usando vôrtex. Centrifugar brevemente para garantir a homogeneização.
- Manter todos os componentes e amostras em gelo para maximizar a especificidade.
Preparo da Mistura de Reação
Componente | Volume | Conc. Final |
2X PROBE qPCR Master Mix | 12.5 µL | 1X |
Primer Forward (20 µM) | 0.5 µL | 0.4 µM (0.2 – 0.8 µM) |
Primer Reverse (20 µM) | 0.5 µL | 0.4 µM (0.2 – 0.8 µM) |
Probe (10 µM) | 0.5 µL | 0.2 µM |
Hot Start Taq DNA Polymerase | 0.5 µL | – |
DNA Template | <10.5 µL | – |
Nuclease-free water | Ajustar para 25 µL | – |
Condições de Amplificação Sugeridas
Protocolo Step Cycling
Estágio | Passo | Temperatura | Tempo |
Hold | Desnaturação Inicial | 95°C | 2 min |
40 ciclos | Desnaturação | 95°C | 15 seg |
Anelamento e Extensão (Aquisição de Dados) | 60°C | 60 seg* |
Observação: O tempo de extensão depende da aquisição de dados, devendo ser ajustado conforme o equipamento de qPCR utilizado.
Protocolo Alternativo Step Cycling
Estágio | Passo | Temperatura | Tempo |
Hold | Desnaturação Inicial | 95°C | 2 min |
40 ciclos | Desnaturação | 95°C | 15 seg |
Anelamento | 50–60°C | 15 seg | |
Extensão (Aquisição de Dados) | 72°C | 45 seg |
Ensaio de Otimização
O desenho de primers e sondas altamente específicos é crucial para uma qPCR bem-sucedida. O uso de programas para desenho de primers é recomendado para evitar a formação de estruturas secundárias e auto-anelamento.
Recomendações:
- O tamanho do amplicon deve ser entre 65–200 pb.
- A concentração de primers deve ser 200–800 nM, com uma concentração ideal de 400 nM por primer e 200 nM para a sonda.
- Dependendo do par de primers, pode ser necessário um protocolo de ciclagem de 3 etapas.