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PROBE qPCR Master Mix – Alta Sensibilidade e Precisão para PCR em Tempo Real – 13-10506-01

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54 em estoque (pode ser encomendado)


Kit de qPCR para detecção precisa de DNA com alta sensibilidade e especificidade. Compatível com diversos termocicladores.

R$628,60 R$655,94

54 em estoque (pode ser encomendado)

PROBE qPCR Master Mix (100 reações x 25µL)

Código: 13-10506-01
Armazenamento: –20°C
Estabilidade: Este kit é estável durante 10 dias à temperatura ambiente.


Descrição

O PROBE qPCR Master Mix é um kit desenvolvido para ensaios de PCR quantitativos (qPCR) utilizando sondas fluorogênicas, incluindo as sondas TaqMan. Ele contém a enzima Hot Start Taq DNA Polimerase, uma polimerase recombinante complexada com um anticorpo monoclonal anti-Taq. Esse mecanismo bloqueia a atividade da enzima à temperatura ambiente, proporcionando um “início a quente” automático para aumentar a sensibilidade e especificidade da detecção.

Este kit foi otimizado para PCR em tempo real que exige alta sensibilidade e especificidade, sendo indicado para:

  • Detecção e quantificação de agentes patogênicos;
  • Identificação de organismos geneticamente modificados;
  • Análise de expressão gênica.

O PROBE qPCR Master Mix é compatível com diversos instrumentos de PCR em tempo real, incluindo modelos que não requerem ROX:

  • Roche: LightCycler 480
  • Qiagen: Rotor-Gene Q / 3000 / 6000
  • Eppendorf: Mastercycler ep / realplex
  • Illumina: Eco qPCR
  • Bio-Rad: CFX96 / CFX384, iCycler iQ / My iQ / IQ5
  • Thermo Scientific: PikoReal Real-Time PCR
  • Applied Biosystems: 7500 / 7500 Rápido / VIIa 7 / QuantStudio 12K Flex
  • Stratagene: Mx3000P / Mx3005P / MX4000
  • Bioer

Componentes do Kit

Cada kit contém reagentes suficientes para 100 reações com volume final de 25µL:

Código Descrição Volume Quantidade
13-10506-01 2X PROBE qPCR Master Mix 1.25 mL 1 tubo
Hot Start Taq DNA Polymerase 50 µL 1 tubo
Amostra q.s.p 10 reações

Protocolo

Este protocolo é para um volume final de reação de 25µL. O volume pode ser ajustado conforme necessário.

Preparo Inicial

  1. Descongelar os componentes à temperatura ambiente.
  2. Ressuspender o 2X PROBE qPCR Master Mix, primers e sonda usando vôrtex. Centrifugar brevemente para garantir a homogeneização.
  3. Manter todos os componentes e amostras em gelo para maximizar a especificidade.

Preparo da Mistura de Reação

Componente Volume Conc. Final
2X PROBE qPCR Master Mix 12.5 µL 1X
Primer Forward (20 µM) 0.5 µL 0.4 µM (0.2 – 0.8 µM)
Primer Reverse (20 µM) 0.5 µL 0.4 µM (0.2 – 0.8 µM)
Probe (10 µM) 0.5 µL 0.2 µM
Hot Start Taq DNA Polymerase 0.5 µL
DNA Template <10.5 µL
Nuclease-free water Ajustar para 25 µL

Condições de Amplificação Sugeridas

Protocolo Step Cycling

Estágio Passo Temperatura Tempo
Hold Desnaturação Inicial 95°C 2 min
40 ciclos Desnaturação 95°C 15 seg
Anelamento e Extensão (Aquisição de Dados) 60°C 60 seg*

Observação: O tempo de extensão depende da aquisição de dados, devendo ser ajustado conforme o equipamento de qPCR utilizado.

Protocolo Alternativo Step Cycling

Estágio Passo Temperatura Tempo
Hold Desnaturação Inicial 95°C 2 min
40 ciclos Desnaturação 95°C 15 seg
Anelamento 50–60°C 15 seg
Extensão (Aquisição de Dados) 72°C 45 seg

Ensaio de Otimização

O desenho de primers e sondas altamente específicos é crucial para uma qPCR bem-sucedida. O uso de programas para desenho de primers é recomendado para evitar a formação de estruturas secundárias e auto-anelamento.

Recomendações:

  • O tamanho do amplicon deve ser entre 65–200 pb.
  • A concentração de primers deve ser 200–800 nM, com uma concentração ideal de 400 nM por primer e 200 nM para a sonda.
  • Dependendo do par de primers, pode ser necessário um protocolo de ciclagem de 3 etapas.

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