Taq DNA Polimerase 5 U/µl 500 U – Enzima Taq DNA Polimerase recombinante, concentração 5U/µl, acompanha tampão 10X e MgCl2. Frasco com 500U

Taq DNA Polimerase 500 U

Concentração: 5 U/µl
Condição de estoque: –20°C.
Apresentação: 1 frasco de Taq DNA Polimerase 500 U
1 frasco de MgCl2 1,25 ml
1 frasco de Tampão 10X 1,5 ml

Descrição:

Taq DNA Polimerase é purificada de E. coli expressando um gene de DNA polimerase clonado de Thermus aquaticus. Esta enzima tem atividade de DNA polimerase 5’ a 3’ e uma atividade de exonuclease 5’ a 3’ mas não possui atividade de exonuclease 3’ a 5’. Esta enzima inalterada consiste de uma simples cadeia polipeptídica com um peso molecular de aproximadamente 94 KDa. Ela exibe alta atividade em pH 8.5 e ótima temperatura a 72C e é estável por longas incubações a elevadas temperaturas (95C).

Definição de unidade:

Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que incorpora 10
nmoles de nucleotídeos presentes em material ácido-insolúvel em 30 minutos a 72°C em condições padrão de ensaio.

Tampão de estoque: 50% glicerol, 20 mM HEPES (pH 7.9), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM
PMSF, 1 mM DTT.

Tampão 10X: 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 500 mM KCl, (sem adição de MgCl2 que é fornecido em
frasco separado na concentração de 50 mM).

Protocolo Básico de Amplificação:
O seguinte protocolo básico serve como uma orientação geral e um ponto de partida para qualquer amplificação. As condições ótimas da reação (tempos e temperaturas de incubação, a
concentração de Taq DNA polimerase, primers, MgCl2 e DNA molde) variam e precisam ser
otimizadas. A PCR deve ser realizada em um ambiente livre de DNA contaminante.

a) Adicione os seguintes componentes em um tubo estéril de microcentrífuga no gelo:

Componentes /Volume Final / Concentração

 

10X Tampão de amostra / 5 µl 1X
2.5 mM dNTP mix / 4µl / 0.2 mM cada
50 mM MgCl2 / 1.5 µl  / 1.5 mM
Primer 1 (25 pmol) / 0.5 µl / 0.5 µM
Primer 2 (25 pmol) / 0.5 µl / 0.5 µM
DNA molde / 0.5-10 µl ——-
Taq DNA Polimerase (5U/µl) / 0.5 µl / 2.5 unid
Água destilada autoclavada para / 50 µl

Se desejado, um Master Mix pode ser preparado para reações múltiplas.

b) Misturar o conteúdo e adicionar 50 µl de óleo mineral ou óleo de silicone.

c) Centrifugar brevemente.

d) Incubar os tubos em um termociclador a 94°C por 2 minutos para desnaturar completamente
o DNA molde.

e) Realizar 25-35 ciclos de amplificação: desnaturar 94°C por 45 segundos; anelamento a 55°C
[geralmente 5-10°C abaixo da Tm] por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto.

f) Incubar por 10 minutos a 72°C. Manter a reação a 4°C ou estocar a -20°C até o uso.

g) Analisar os produtos de amplificação por eletroforese em gel de agarose e visualizar com
brometo de etídio.